理化动态发酵分析和抗活性自然指标苹果氧化酵素

食用植物酵素(edible plant Jiaosu)是自然指标指 以可用于食品加工的植物为主要原料，添加 或不添加辅料，发酵分析经微生物发酵制得的苹果含有特定 生物活性成分可供人来食用的酵素产品. 其在含有植物本身的多种维生素、酶和矿物 质等营养物质的酵素同时，还通过微生物发酵产生 新的理化次生代谢物及活性成分，与直接食用蔬菜 水果相比，和抗活性酵素中的氧化生物活性成分和有机小分 子更为浓缩，而且更容易为人体所吸收。动态 食用植物酵素作为一种功能性微生物发酵制 品因其丰富的自然指标营养和显著的功效多年来盛行 于欧美、东南亚、发酵分析日本以及台湾地区，苹果受到 国内外学者的酵素普遍关注4。目前有关自然发 酵苹果酵素的理化研究多以短期发酵为主，杨小 幸等在发酵第21天时获得了较高总酚含 量与DPPH自由基清除率的和抗活性苹果酵素，李飞 等研究发现，氧化发酵50d的苹果醛素的抗氧 化活性基本呈现上升趋势。但以上研究由于 发酵周期较短，产品品质不稳定，酒精含量 容易超标，而且研究表明，酵素是时间的产 物，随着发酵时间的延长，产品中的活性物 质逐渐增加7"1，因此进一步阐明苹果酵素 自然发酵过程中理化指标和抗氧化活性的动 态变化很有必要的。笔者以富士苹果为原料， 研究了苹果酵素自然发酵过程中理化指标和 抗氧化活性的变化，以期为进一步阐明苹果 酵素保健功能机理和综合性开发提供依据。

1材料与方法

1.1材料与试剂

指示富士苹果品种为长富2号，采自甘 肃省庆阳市有机苹果基地之一的庆阳市西峰 区什社乡。供试冰糖为市售，供试纯净水为 自制。供试氢氧化钠、酚酞、DPPH、乙醇、 ABTS、过硫酸钾、铁氰化钾、三氯化铁、 硫酸亚铁、水杨酸、双氧水、Tris、邻苯三 酚、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠等均由中瑞化 学试剂公司提供，均为分析纯。

1.2仪器与设备

Uv-1100型紫外可见分光光度计〔上海 凌析达仪器有限公司)、LRH-70型恒温培养 箱(上海一恒科学仪器有限公司)、YXQLS75G型立式压力蒸汽灭菌锅(上海博迅实业有 限公司医疗设备厂)、DK-S24数显恒温水浴 锅(上海精宏实验设备有限公司)、MIRCOCL17R离心机[赛默飞世尔科技(中国)有限公 司]、超低温冰箱(青岛海尔集团)、DL-CJ1N超净工作台(北京东联哈尔仪器制造有限 公司)、PB-10型精密pH计[赛多利斯科学 仪器(北京)有限公司]。

1.3试验方法

1.3.1苹果酵素生物发酵生产工艺流程旳苹 果原料选择→清洗→去核→切分→装罐→加 水、加糖→发酵→过滤→成品。

1.3.2操作要点新鲜苹果用纯净水冲洗干 净，沥干水分后去核并切分成3~5 mm的 片，冰糖破碎后用紫外灯辐照处理30 min。 将苹果片与纯净水按质量比200 : 1 000 加 入无菌酵素发酵罐中，加人15%的冰糖调节 糖度，置阴凉干燥的发酵车间，常温(20～26℃)下自然发酵30 d后滤去果肉(防止产 生过多不利于健康的氨氮等)，继续发酵至90d。发酵第Ⅰ个月隔天搅拌通气，第2个 月有氧发酵，之后密封发酵，发酵结束取上 清液进行指标测定。每组试验均重复3次。

1.3.3理化指标变化︰总酸含量参照GB T124562008的方法测定， pH采用pH 计法测定，可溶性固形物含量采用糖度计法 测定-u1，乙醇含量采用密度瓶法测定.

1.3.4抗氧化活性测定DPPH自由基清除 能力、超氧自由基清除能力、羟基自由基清 除能力、ABTS自由基清除能力测定均参考 樊秋元[ ]的方法。

1.4统计学处理

试验数据采用Excel 2010、sPSS 22.0数据分析软件进行分析处理及作图。

2结果与分析

2.1苹果酵素自然发酵过程中的理化指标 变化

可溶性固形物、pH、总酸、乙醇等是 衡量苹果酵素发酵成熟的主要理化指标，也 是影响酵素品质的重要因素。由图1 可以看出，可溶性固形物含量随着发酵时间 的延长呈现不断下降的趋势，发酵30 d 内营养充分，微生物快速繁殖，迅速消耗碳 水化合物，使酵素液中可溶性固形物含量迅 速从15.0°Brix降至7.2°Brix;随后缓慢降 低，发酵90d时可溶性固形物含量降为4.5 Brix，比发酵初期降低了70%。pH随着发 酵时间的延长而逐渐降低，发酵前30 d迅 速从4.50降低至3.22，说明微生物在发酵 前期为大量繁殖阶段，随后由于有机酸的积 累pH平稳下降至发酵结束时的3.06，与发 酵初期相比，pH下降了32%，同时因为微 生物的生长代谢产生的二氧化碳在水中形成 气泡，可能由于气泡的不稳定性，致使pH 在下降的同时也出现回升的情况。总酸 在发酵前30 d 逐渐升高，从最初的0.9 gL 升高至3.2 gL，这可能是因为发酵前期为通 气发酵阶段，微生物代谢产生的二氧化碳和 有机酸使得总酸含量逐渐升高;发酵30～60 d 总酸含量快速升高至36.7 gL，此阶段 为有氧发酵阶段，发酵液中的乙醇、己糖等 代谢产物通过微生物发酵转化为乙酸和乳酸 等有机酸，既提高了苹果酵素的营养物质， 又形成其独特的风味;随后由于发酵缓慢，总酸含量略有升高，至发酵结束总酸含 量达到42.9g/L，与发酵初期相比总酸含量 增加了98%。乙醇含量随着发酵时间的延长 呈先升高后降低的趋势，发酵30d内碳水 化合物含量高，微生物发酵产生大量的乙 醇，导致乙醇含量从0迅速增加至79.0 g/L, 随后通过有氧发酵促使乙醇生成乙酸，乙 醇含量迅速降低至13.0 g/L, 60 d后缓慢降 低，在发酵90 d时乙醇含量为10gL,符合 QB/T5323- 2018 有关规定。

2.2苹果酵素自然发酵过程中抗氧化能力 的变化

通过比较分析DPPH自由基清除率、超. 氧阴离子自由基清除率、羟基自由基清除 率、ABTS自由基清除率等4种抗氧化活性 体系，对苹果酵素自然发酵过程中抗氧化能 力进行评价。由图2可以看出，DPPH自由. 基清除率、超氧阴离子自由基清除率、羟基 自由基清除率、ABIS自由基清除率在苹果 酵索发酵过程中抗氧化能力变化规律大体较 为一致，DPPH自由基清除率和羟基自由基 清除率发酵前60d逐渐上升，60d后趋于 稳定上升;发酵90d时自由基清除率分别 从发酵初期的47.82%和43.05%上升至86.16%和79.03%，升高了44.50%和45.53%。 超氧阴离子自由基清除率和ABIS自由基清 除率发酵前75 d逐渐上升并达到峰值，分 别为65.06%和69.04%，与发酵初期相比分 别升高了39.12%和46.47%，随后略有降低。 说明发酵75~90d时的苹果酵素抗氧化活 性较好，这可能与该阶段通过微生物代谢酵素中积累了较多的抗氧化物质、功效酶以及 微生物的多样性有关。

3结论与讨论

研究表明，苹果酵素自然发酵过程中，30 d内酵素液中碳水化合物充足，微生物迅 速生长繁殖，可溶性固形物含量和pH迅速 降低﹔随后进人平稳变化阶段，总酸含量逐 渐升高，乙醇含量先升高后降低，发酵至60 d时才逐渐进入平稳变化阶段。在发酵90 d时，可溶性固形物含量降为4.5Brix, 与发酵初期相比降低了70%，pH下降至3.06，降低了32%;总酸含量增加至42.9 gL，增加了98%，乙醇含量为1.0 gL，符 合QB/T5323—2018规定。苹果酵素发酵75~90 d时抗氧化活性较好，DPPH自由基 和羟基自由基在发酵0 d时清除率分别为86.16%和79.03%，分别升高了44.5%.45.53%;超氧阴离子自由基清除率和ABTS 自由基的清除率呈现发酵前75 d逐渐上升 达到峰值，分别为65.06%和69.04%，分别 升高了39.12%和46.47%，这可能是由于通 过微生物代谢酵素中积累了较多的抗氧化物 质和功效酶，并且微生物多样性较好。 有关抗氧化物质如总酚、总黄酮，功效酶如 超氧化物歧化酶(SOD)活性等以及微生物多 样性与抗氧化活性之间的关系有待于研究。

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